今天（6月6日）是第28個(gè)全國(guó)愛(ài)眼日，旨在營(yíng)造全社會(huì)愛(ài)眼護(hù)眼的良好氛圍。那么你是否知道，今年的愛(ài)眼日主題是什么呢？

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為關(guān)注罕見(jiàn)病研究，賽業(yè)生物全新策劃罕見(jiàn)病“十宗罪”專(zhuān)欄，旨在從罕見(jiàn)病的致病機(jī)理、臨床前疾病模型、基因治療方法等多個(gè)角度出發(fā)，深入研究罕見(jiàn)病發(fā)生和發(fā)展的原因。通過(guò)探索這些罕見(jiàn)病的原罪，我們希望能夠開(kāi)發(fā)更為完善的疾病模型，同時(shí)促進(jìn)罕見(jiàn)病相關(guān)藥物的研發(fā)。本期全國(guó)愛(ài)眼日特輯，讓我們一起來(lái)關(guān)注眼科罕見(jiàn)病——由RHO基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性。

RHO及相關(guān)致病機(jī)理

RHO的研究始于上世紀(jì)50年代。1957年，美國(guó)生物化學(xué)家George Wald發(fā)現(xiàn)了視覺(jué)反應(yīng)所需的光敏色素，即視紫紅質(zhì)（Rhodopsin, RHO）[1]，Wald的發(fā)現(xiàn)為后來(lái)可能實(shí)現(xiàn)的視覺(jué)復(fù)原技術(shù)提供了重要基礎(chǔ)。RHO突變是主要的導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的罪魁禍?zhǔn)?/strong>，大多數(shù)RHO突變會(huì)導(dǎo)致紫紅蛋白在感光細(xì)胞中高水平表達(dá)，使得大量的突變蛋白在細(xì)胞中定位異常并聚集，造成感光細(xì)胞凋亡，不能行使正常的光信號(hào)傳導(dǎo)功能，其中P23H是RHO突變占比最多的一種致病突變。

早在2000年就有研究人員將野生型RHO基因轉(zhuǎn)入P23H轉(zhuǎn)基因大鼠（該大鼠患有視網(wǎng)膜色素變性）中，發(fā)現(xiàn)遞送療法顯著減緩了P23H轉(zhuǎn)基因大鼠的光感受器退化速度[2]，但是，僅僅補(bǔ)充RHO的表達(dá)就可以治療由RHO基因突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa, RP）嗎？答案顯然不是的，因?yàn)獒槍?duì)像RHO-adRP這樣的顯性疾病，還必須同時(shí)擺脫對(duì)細(xì)胞有害的基因產(chǎn)物。

RHO基因治療研究進(jìn)展

我們來(lái)看看在RHO相關(guān)的基因治療中，如何通過(guò)1+1=1的方式治療RP（即兩種方式作用于同一種疾?。?/strong>。

1 AAV遞送

Roche和Spark合作開(kāi)發(fā)的藥物RhoNova通過(guò)AAV2/5遞送shRNA抑制內(nèi)源性RHO突變基因表達(dá)+補(bǔ)充野生型RHO基因表達(dá)=治療RHO突變導(dǎo)致的RP（shRNA+WT-RHO=RP），臨床前研究使用P23H轉(zhuǎn)基因小鼠作為藥效研究模型[3]。

但更早期的臨床前實(shí)驗(yàn)表明，shRNA的抑制效果在犬疾病模型和人細(xì)胞中是有效的，但是在小鼠的Rho序列中是不保守的[4]。這表明P23H轉(zhuǎn)基因大小鼠模型對(duì)于篩選高效的、與患者體內(nèi)療效一致的shRNA是有缺陷的，因?yàn)槠鋬?nèi)源性Rho基因與人RHO基因的不完全一致性，并不是理想的研究RP相關(guān)基因治療的臨床前疾病模型。

2?靶向RHO的CRISPR療法

張鋒創(chuàng)立的Editas公布了其體內(nèi)基因編輯療法EDIT-103用于治療由RHO突變導(dǎo)致的RP的相關(guān)成果。EDIT-103是一種不依賴(lài)于突變的基于CRISPR/Cas9的基因編輯療法，遞送敲除和補(bǔ)充突變RHO基因的雙AAV5載體，以保持感光器功能。該療法有望解決150多種RHO突變導(dǎo)致的RP，同樣也是通過(guò)gRNA和Cas9靶向突變RHO來(lái)抑制其表達(dá)+補(bǔ)充野生型RHO基因表達(dá)=治療RHO突變導(dǎo)致的RP（Cas9+WT-RHO=RP）。

值得注意的是，為了篩選高效且特異的gRNA，在臨床前動(dòng)物模型中，研究人員非常聰明地使用了人源化RHO小鼠模型（mRhohRHO/+），即人RHO基因原位替換鼠源Rho基因。臨床前研究表明，hRHO在小鼠體內(nèi)正常表達(dá)，且EDIT-103在該人源化RHO小鼠中表現(xiàn)出顯著的敲除和遞送效果[5]。不難發(fā)現(xiàn)，在RP相關(guān)的基因療法中，疾病模型攜帶人源基因?qū)τ诤Y選高效特異的藥物是必要條件，人源化疾病模型小鼠是RP相關(guān)藥物研發(fā)中更好的疾病模型。

應(yīng)運(yùn)而生的全基因組人源化模型HUGO-GTTM

Editas公布的管線中除了RHO突變導(dǎo)致的RP，還有CEP290突變導(dǎo)致的先天性黑曚癥10型、USH2A突變導(dǎo)致的Usher綜合征、SERPINA1突變導(dǎo)致的α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、CFTR突變導(dǎo)致的囊性纖維化等疾病管線，這些管線的臨床前疾病模型都使用到了人源化小鼠。

為加速新藥研發(fā)，「下一代全基因組人源化模型構(gòu)建計(jì)劃」HUGO-GTTM?Program應(yīng)運(yùn)而生（HUGO-GT: Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy）。即在罕見(jiàn)病數(shù)據(jù)中心RDDC（一站式獲取疾病-基因-動(dòng)物模型-藥物臨床信息的生物數(shù)據(jù)平臺(tái)）的基礎(chǔ)上，賽業(yè)生物通過(guò)TurboKnockout技術(shù)與BAC融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因組大片段替換，構(gòu)建了更適用于遺傳性疾病研究和基因治療藥物開(kāi)發(fā)的全基因組人源化模型。

在眼科疾病領(lǐng)域，賽業(yè)生物自主研發(fā)的全基因組人源化小鼠包括野生型全基因組人源化小鼠hRHO以及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的P23H點(diǎn)突變疾病模型hRHO-P23H，以及hCEP290等其他眼科模型。

[1]Wald G . THE MOLECULAR BASIS OF VISUAL EXCITATION[J]. American Scientist, 1954, 42(1):73-95.

[2]Lavail M M , ?Yasumura D , ?Matthes M T , et al. Ribozyme rescue of photoreceptor cells in P23H transgenic rats: Long-term survival and late-stage therapy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(21):11488-11493.

[3]Meng D , ?Ragi S D , ?Tsang S H . Therapy in Rhodopsin-Mediated Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa[J]. Molecular Therapy, 2020, 28(10).

[4]Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(36):E8547-E8556.

[5]https://ir.editasmedicine.com/news-releases/news-release-details/editas-medicine-presents-preclinical-data-edit-103-rhodopsin-0